PCR-tekniikalla on oltava keinotekoisesti syntetisoituja kohtuullisia alukkeita ja uutettua näyte-DNA:ta, minkä jälkeen suoritettava automaattinen lämpökierto ja lopuksi suoritettava tuotteen tunnistaminen ja analyysi. Tällä hetkellä pohjamaalien suunnittelua ja synteesiä voidaan tehdä vain muutamassa tutkimuslaitoksessa, laitoksessa ja klinikalla, joilla on vahva tekninen vahvuus. Sovelluksen tarvitsee vain ostaa PCR-tunnistussarja aloittaakseen työn. PCR:n automaattiseen lämpökiertoon on monia vaikuttavia tekijöitä. Eri DNA-näytteillä PCR-reaktiossa lisättyjen eri komponenttien määrä ja lämpötilasyklin parametrit ovat epäjohdonmukaisia.
Useita tärkeimpiä vaikuttavia tekijöitä esitellään nyt seuraavasti.
Yksi, lämpötilasyklin parametrit
PCR-automaattisessa lämpösyklissä kriittisin tekijä on denaturoinnin ja hehkutuksen lämpötila. Kuten toimintaesimerkissä näkyy, denaturoinnin, pariutumisen ja pidentämisen olosuhteet ovat: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, yhteensä 25°30 A sykli, monistettu fragmentti on 500 bp. Tässä kunkin vaiheen aika tulisi laskea sen jälkeen, kun reaktioseos saavuttaa vaaditun lämpötilan. Automaattisessa lämpösyklilaitteessa aika seoksen alkuperäisestä lämpötilasta vaadittuun lämpötilaan kestää 30-60 s. Tämän viiveajan pituus riippuu useista tekijöistä, mukaan lukien reaktioputken tyyppi, seinämän paksuus, reaktioseoksen tilavuus, lämpö lähde (vesihaude tai lämmityslohko) ja kahden vaiheen välinen lämpötilaero, joka tulee ottaa riittävästi huomioon lämpösykliä asetettaessa. Kiinnitä huomiota ja harkitse, ja varsinainen mittaus tulee suorittaa jokaiselle instrumentille.
Toinen tärkeä näkökohta lämpösyklin aikana on kahden alukkeen välinen etäisyys; mitä kauempana on etäisyys, sitä kauemmin kohdesekvenssin koko pituinen syntetisointi kestää. Yllä annettu reaktioaika perustuu optimaaliseen synteesin pituuteen 500 bp. Kohdesekvenssi laaditaan. Tässä on johdatus eri lämpötilojen valintaan.
1. Templaatin denaturaatiolämpötila Denaturaatiolämpötila määrittää lämpötilan, jossa kaksijuosteinen DNA sulaa PCR-reaktiossa. Jos denaturaatiolämpötilaa ei saavuteta, yksijuosteista DNA-templaattia ei tuoteta, eikä PCR käynnisty. Matala denaturaatiolämpötila tarkoittaa epätäydellistä denaturaatiota, DNA kaksijuosteinen Se renaturoituu nopeasti, mikä vähentää saantoa. Yleensä 90-95 ℃. Kun näyte saavuttaa tämän lämpötilan, se tulee jäähdyttää nopeasti hehkutuslämpötilaan. DNA:n denaturaatio kestää vain muutaman sekunnin, eikä se ole tarpeen pitkään; päinvastoin, sinun tulee yrittää parhaansa korkeassa lämpötilassa. Lyhennä sitä säilyttääksesi Taq DNA -polymeraasin aktiivisuuden. Maksimidenaturaatiolämpötila Taq DNA -polymeraasin lisäämisen jälkeen ei saa ylittää 95 °C.
2. Alukkeen pariutumislämpötila Pariutumislämpötila määrittää PCR:n spesifisyyden ja saannon; jos lämpötila on korkea, spesifisyys on vahva, mutta jos lämpötila on liian korkea, aluketta ei voida yhdistää tiukasti templaatin kanssa ja DNA:n monistustehokkuus heikkenee; lämpötila on alhainen, saanto korkea, mutta liian alhainen voi aiheuttaa pohjusteen ja mallin yhteensopimattomuuden, Epäspesifiset tuotteet lisääntyvät. Aloita yleensä reaktio-olosuhteista 37 ℃, aseta sarja kontrollireaktioita määrittääksesi optimaalisen pariutumislämpötilan tietylle reaktiolle. Se voidaan päätellä myös alukkeiden (G+C)% pitoisuuden perusteella testin ymmärtämiseksi. Yleisen testin lähtökohta, hehkutuslämpötila Ta (hehkutuslämpötila) on 5℃ alempi kuin sulamislämpötila TTm (sulamislämpötila) monistusalukkeesta, joka voidaan laskea kaavan mukaan:
Ta = Tm-5℃ = 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Niiden joukossa A, T, G ja C edustavat vastaavasti vastaavien emästen lukumäärää. Esimerkiksi 20 emäksen alukkeelle, jos (G+C)%:n pitoisuus on 50%, Ta:n aloituspisteeksi voidaan asettaa 55 °C. Tyypillisellä alukepitoisuudella (kuten 0,2 μmol/L) pariutumisreaktio voidaan suorittaa loppuun muutamassa sekunnissa, eikä pitkäkestoinen pariutuminen ole tarpeen.
3. Alukkeen pidennyslämpötilan valinta riippuu Taq DNA -polymeraasin optimaalisesta lämpötilasta. Yleensä 70–75 ℃, entsyymitatalysoimien nukleotidien standardinopeus 72 ℃:ssa voi olla 35–100 nukleotidia/s. minuutissa. 1 kb:n pituutta voidaan pidentää ja sen nopeus riippuu puskuriliuoksen koostumuksesta, pH-arvosta, suolapitoisuudesta ja DNA-templaatin luonteesta. Jos monistettu fragmentti on lyhyempi kuin 150 bp, pidennysvaihe voidaan jättää pois ja siitä tulee kaksoislämpötilasykli Taq DNA:n takia. Polymeraasi riittää saattamaan lyhyiden sekvenssien synteesin päätökseen pariutumislämpötilassa. Lyhyiden sekvenssien 100 ja 300 bp:n fragmenttien kohdalla on tehokasta käyttää nopeaa ja yksinkertaista kaksoislämpötilasykliä. Tällä hetkellä alukkeen pidennyslämpötila on sama kuin hehkutuslämpötila. Yli 1 kb:n DNA-fragmenttien pidennysaikaa voidaan säätää 1 - 7 minuutin sisällä fragmentin pituuden mukaan. Samanaikaisesti PCR-puskuriin tulisi lisätä gelatiinia tai BSA-reagenssia, jotta Taq DNA -polymeraasi pysyy aktiivisena ja stabiilina pitkän aikaa. Seksi; 15–20 % glyseroli auttaa monistamaan noin 2,5 kb:n tai pidempiä DNA-fragmentteja.
4. Tavanomaisen PCR:n syklien lukumäärä on yleensä 25-40 sykliä. Yleinen virhe on, että jaksojen määrä on liian suuri, epäspesifinen tausta on vakava ja monimutkaisuus lisääntyy. Tietenkin reaktion syklien lukumäärä on liian pieni ja saanto alhainen. Siksi on tarpeen varmistaa, että tuote saadaan. Nopeuden oletuksen mukaan jaksojen lukumäärä tulisi minimoida.
Kun monistus on valmis, näyte jäähdytetään ja säilytetään 4 °C:ssa.
2. Primer Primer Design
Templaatti-DNA:n monistamiseksi sinun on ensin suunniteltava kaksi oligonukleotidialuketta. Niin kutsutut alukkeet ovat itse asiassa kaksi oligonukleotidifragmenttia, jotka ovat komplementaarisia monistettavalle kohde-DNA-sekvenssille. Kahden alukkeen välinen etäisyys määrittää monistetun fragmentin pituuden. , Kahden alukkeen 5'päät määrittävät amplifioidun tuotteen kahden 5'pään sijainnit. Voidaan nähdä, että alukkeet ovat avain PCR:llä monistettujen fragmenttien pituuden, sijainnin ja tulosten määrittämisessä, ja alukkeen suunnittelu on tärkeämpi.
Alukkeen suunnittelun välttämätön ehto on, että alukkeelle komplementaarinen kohde-DNA-sekvenssi on tunnettava. Kahden alukkeen välinen sekvenssi ei välttämättä ole selvä. Kaksi tunnettua sekvenssiä ovat yleensä 15-20 emästä, jotka voidaan syntetisoida DNA-syntetisaattorilla. Vastaavasti kahta toisiaan täydentävää aluketta, pohjamaalien suunnittelussa yleisesti noudatettuja periaatteita ovat:
1. Alukkeen pituus lasketaan tilastojen mukaan, ja todennäköisyys, että noin 17 emäksen pituinen oligonukleotidisekvenssi voi esiintyä ihmisen genomissa, on kerran. Siksi alukkeen pituus on yleensä vähintään 16 nukleotidia ja korkein enintään 30 nukleotidia, ja paras pituus on 20-24 nukleotidia. Tällaiset lyhyet oligonukleotidit eivät muodosta stabiilia hybridiä polymerointilämpötilassa (joka ylittää 72 °C). Joskus se voi olla 5' Lisää loppuun sekvenssejä, jotka eivät ole komplementaarisia templaatin kanssa, kuten restriktioentsyymikohdat tai promoottorit, geenikloonauksen ja muiden erityistarpeiden suorittamiseksi loppuun; alukkeen 5'pään biotiinileimaa tai fluoresoivaa leimaa voidaan käyttää erilaisiin tarkoituksiin, kuten mikrobien havaitsemiseen.
Joskus aluke ei toimi' syy on tuntematon, voit siirtää paikkaa ratkaistaksesi sen.
2. (G+C) % -pitoisten alukkeiden koostumuksen tulee olla tasainen, ja pyri välttämään saman peruspolymeerin sisältämistä. Kahden alukkeen (G+C) % -pitoisuuden tulee olla mahdollisimman samanlainen, tunnetussa monistetun fragmentissa (G+C) % -pitoisuuden tulee olla lähellä monistettavaa fragmenttia, yleensä 40-60% on parempi.
3. Pohjusteen sisällä tulee välttää ilmeisten sivurakenteiden muodostumista, erityisesti hiusneularakenteita. Esimerkiksi:
4. Kahden alukkeen välillä ei saa olla komplementaatiota alukkeiden välillä, etenkään alukkeen 3'päässä. Vaikka sitä ei voida välttää, 3'pään täydentävä emäs ei saa olla suurempi kuin 2 emästä, muuten on helppo muodostaa"alukedimeeri" Tai"Alukedimeeri" (Alukedimeeri). Niin kutsuttu alukedimeeri on olennaisesti kaksijuosteinen DNA-fragmentti, joka muodostuu yhden alukkeen pidentämisestä toiseen alukesekvenssiin DNA-polymeraasin vaikutuksesta. , On PCR:n yleinen sivutuote, ja joskus siitä tulee jopa päätuote.
Vältä lisäksi homologisia sekvenssejä kahden alukkeen välillä, erityisesti oligonukleotidifragmentteja, joissa on enemmän kuin 6 peräkkäistä identtistä emästä, muuten nämä kaksi aluketta kilpailevat keskenään templaatin samasta kohdasta; Samoin monistettavalla alukkeella ja kohde-DNA:lla tai muilla näyte-DNA:n sekvensseillä ei voi olla yli 6 emäksen homologisia sekvenssejä. Muuten alukkeet sitoutuvat muihin kohtiin vähentäen spesifistä monistumista ja lisäämällä epäspesifistä monistumista.
5. Alukkeen 3'pään paritus DNA-polymeraasi lisää yhden nukleotidin alukkeen 3'päähän. Siksi alukkeen 3':n päästä ja kohde-DNA:n päästä olevien 5-6 emäksen pariliitosvaatimusten on oltava tarkkoja ja tiukkoja tehokkaan PCR-monistuksen varmistamiseksi. .
Pohjamaalin suunnittelun kohtuullisuus voidaan varmistaa tietokonehaulla PCRDESN-ohjelmistolla ja American PRIMER -ohjelmistolla.
Keinotekoisesti syntetisoidut oligonukleotidit tulisi edullisesti puhdistaa kromatografialla (kromatografialla) tai PAGE:lla epäpuhtauksien, kuten lyhyiden ketjujen, poistamiseksi, joita ei ole syntetisoitu täysimittaisesti. Puhdistetut alukkeet, joita säilytetään 25-prosenttisessa asetonitriililiuoksessa 4°C:ssa, voivat estää mikro-organismeja Normaalioloissa käyttämättömät alukkeet tulee säilyttää jääkaapissa -20°C:ssa. Pohjusteita voidaan säilyttää nesteessä 6 kuukautta, ja niitä voidaan säilyttää 1-2 vuotta lyofilisoinnin jälkeen.
