PCR:n periaate on käyttää DNA:ta, joka denaturoituu ja muuttuu yksijuosteiseksi korkeassa 95°C:n lämpötilassa in vitro. Matalissa lämpötiloissa (yleensä noin 60 °C) alukkeet ja yksijuosteet yhdistetään emäskomplementaarisen pariutumisen periaatteen mukaisesti ja sitten lämpötila säädetään DNA-polymeraasiin. Optimaalisessa reaktiolämpötilassa (noin 72 °C) DNA-polymeraasi syntetisoi komplementaarisia juosteita fosforihapon suunnassa viideksi hiilisokeriksi (5'-3').
PCR:n arvokkain sovellusalue on infektiotautien diagnosointi. Teoriassa niin kauan kuin näytteessä on taudinaiheuttaja, PCR voidaan havaita.
Kokeissa havaittiin, että DNA voidaan denaturoida ja sulattaa myös korkeissa lämpötiloissa, ja se voidaan renaturoida uudelleen kaksoisjuosteiksi, kun lämpötilaa lasketaan. Siksi kontrolloimalla DNA:n denaturaatiota ja renaturaatiota lämpötilan muutoksilla, suunnittelualukkeiden, DNA-polymeraasin ja dNTP:iden lisääminen voi saattaa loppuun spesifisten geenien replikaation in vitro.
DNA-polymeraasi kuitenkin inaktivoituu korkeissa lämpötiloissa. Siksi jokaisessa syklissä on lisättävä uutta DNA-polymeraasia, joka ei ole vain työlästä toimia, vaan myös kallista, mikä rajoittaa PCR-tekniikan soveltamista ja kehittämistä.
