1. Liota viljelylevyssä PBS:llä kiipeätyt objektilasit kolme kertaa 3 minuutin ajan joka kerta.
2. Kiinnitä objektilasit 4-prosenttisella paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja liota objektilasit PBS:ssä 3 kertaa, 3 minuuttia joka kerta.
3. Permeabilisoi 0,5-prosenttisella Triton X-100:lla (valmistettu PBS:ssä) 20 minuuttia huoneenlämpötilassa (solukalvolla ekspressoituneiden antigeenien osalta tämä vaihe jätetään pois).
4. Seerumin esto: upota objektilasit PBS:ään 3 kertaa 3 minuutiksi joka kerta, kuivaa PBS imukykyisellä paperilla, lisää objektilaseille normaalia vuohen seerumia (edellyttäen, että toissijainen vasta-ainelähde on vuohi) ja blokaa huoneenlämmössä 30 min.
5. Lisää primäärinen vasta-aine: Imeytä estoliuos imukykyiseen paperiin, älä pese, lisää jokaiseen objektilasiin riittävä määrä laimennettua primääristä vasta-ainetta ja laita se märkään laatikkoon, inkuboi 4 asteessa yön yli.
6. Lisää fluoresoiva sekundaarinen vasta-aine: upota objektilasit PBST:hen 3 kertaa, 3 minuuttia joka kerta, ime ylimääräinen neste objektilaseilla imukykyisellä paperilla, lisää laimennettu fluoresoiva sekundaarinen vasta-aine tipoittain, inkuboi 20-37 asteessa 1 tunnin ajan. kosteassa laatikossa, liota PBST Slice -viipaleessa 3 kertaa, 3 minuuttia joka kerta.
Huomautus: Fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineen lisäämisen jälkeen kaikki seuraavat vaiheet tulee suorittaa mahdollisimman pimeässä paikassa.
7. Seerumin esto: pyyhi neste imukykyisellä paperilla, pudota normaalia vuohen seerumia lasilevylle (edellyttäen, että toissijainen vasta-ainelähde on vuohi) ja blokaa huoneenlämmössä 30 minuuttia.
8. Lisää primäärinen vasta-aine: Imeytä estoliuos imukykyiseen paperiin, älä pese, lisää sitten laimennettu primäärinen vasta-aine tipoittain ja inkuboi yön yli 4 asteen kosteassa laatikossa pimeässä primaarisen vasta-aineen lisäämisen jälkeen. (Huomaa: toisen primaarisen vasta-aineen laji on eri kuin ensimmäisen primaarisen vasta-aineen laji, kuten hiiri ja kani)
9. Lisää fluoresoiva sekundaarinen vasta-aine: upota objektilasit PBST:hen 3 kertaa, 3 minuuttia joka kerta, ime ylimääräinen neste objektilaseilla imukykyisellä paperilla, lisää laimennettu fluoresoiva sekundaarinen vasta-aine tipoittain, inkuboi 20-37 asteessa 1 h kosteassa laatikossa, liota PBST Slice -viipaleessa 3 kertaa, 3 minuuttia joka kerta. (Huomaa: Jos punainen fluoresenssi valitaan ensimmäisen vasta-aineen havaitsemiseen, toisen on valittava muut fluoresenssin värit)
10. Vastavärjäys ytimet: DAPI lisättiin tipoittain ja inkuboitiin pimeässä 5 minuuttia, näytteet värjättiin ja ylimääräinen DAPI pestiin pois PBST:llä 5 min x 4 kertaa.
11. Kuivaa objektilasilla oleva neste imukykyisellä paperilla, sulje objektilasi kiinnitysnesteellä, joka sisältää antifluoresenssisammutinta, ja tarkkaile ja kerää kuvia fluoresenssimikroskoopilla.