1. Solujen palautuminen
Sen jälkeen kun kylmäsäilötyt solut oli poistettu nestetypestä, ne sulatettiin jatkuvasti ravistellen 37-asteisessa vesihauteessa. Siirrä sulatetut solut sentrifugiputkeen, lisää esilämmitetty DMEM-täydellinen elatusaine 37 asteeseen (josta naudan sikiön seerumi on noin 10 prosenttia), puhalla varovasti tasaisesti, sentrifugoi 500 g:ssä 2 minuuttia ja hävitä supernatantti.
Lisää DMEM-alustaa pestäväksi ja hävitä supernatantti. Lisää täydellinen DMEM-elatusaine, sekoita varovasti pipetoimalla, tee solususpensio, siirrosta se petrimaljaan/pulloon ja viljele soluinkubaattorissa, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta.
2. Solujen kulku
Kun solutiheys saavuttaa 80-90 prosenttia (ennenaikainen saanto on riittämätön, liian myöhäiset solut ovat huonossa kunnossa, jatkoviljely suhteessa 1:2-1:10 tai enemmän, yleensä 1:3-1:5 solujen sukupolvi, eli solusiirrosta Erottamisen ja uudelleenviljelyn aikana täydellinen alusta poistettiin ja pestiin kahdesti 1X PBS:llä.
Lisää trypsiini (huom: digestioliuoksen määrä peittää parhaiten solut ja optimaalinen digestiolämpötila on 37 astetta. Tarkkaile soluja mikroskoopilla: tarkkaile pilkottuja soluja käänteismikroskoopilla, jos sytoplasma vedetään sisään, solut eivät ole enää yhteydessä toisiinsa. Viipaleita, jotka osoittavat, että solut ovat tällä hetkellä sulatettu oikein), sulattaa ne ja aseta ne soluinkubaattoriin noin 2-3 minuutiksi.
Lisää sopiva määrä täydellistä DMEM-elatusainetta trypsinisoitumisen lopettamiseksi, siirrä sentrifugiputkeen ja sentrifugoi 500 g:llä 2 minuuttia, hävitä supernatantti, lisää DMEM-täydellistä alustaa pesua varten ja hävitä supernatantti.
Lisää täydellinen DMEM-elatusaine, sekoita varovasti pipetoimalla, pipetoi 10 mikrolitraa laskemista varten ja jatka sitten viljelyä soluinkubaattorissa, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta vaaditun solutilavuuden mukaan.
3. Solujen kylmäsäilytys
Kun solutiheys saavuttaa 80-90 prosenttia, poista koko alusta ja pese 2 kertaa 1X PBS:llä. Lisää trypsiini sulatusta varten ja laita soluinkubaattoriin noin 2-3 minuutiksi. Lisää täydellinen DMEM-elatusaine trypsiinin digestion lopettamiseksi, siirrä sentrifugiputkeen ja sentrifugoi 500 g:ssä 2 minuuttia, hylkää supernatantti, lisää DMEM-täydellistä alustaa pesua varten ja hävitä supernatantti. Lisää 1 ml pakastusliuosta (90 prosenttia naudan sikiön seerumia, 10 prosenttia DMSO:ta. Yleisesti ottaen seerumipitoisuutta voidaan säätää 10 prosentin ja 90 prosentin välillä. Seerumin lisääminen pakastusliuokseen voi toisaalta tarjota ravinteita soluille, ja Anna solujen kylmäsäilytyksen aikana läpäisemättömiä suoja-aineita, kuten sakkaroosia, albumiinia jne. suojaamaan soluja paremmin, laita se kylmäsäilytysputkeen (putkessa on isopropyylialkoholia lämpötilan alenemisen nopeuden varmistamiseksi), laita välittömästi Pakasta 4-asteisessa jääkaapissa 30 minuuttia, aseta se sitten -20-asteiseen jääkaappiin 30 minuutiksi ja aseta se sitten -80-asteiseen jääkaappiin yön yli.
Laita se seuraavana päivänä nestetyppeen, se säilyy vähintään kaksi vuotta, ja jos et laita nestetyppeen, se säilyy kolme kuukautta.
Solujen kylmäsäilytyksen ja talteenoton periaate on: hidas jäädytys ja sulatus, mikä edistää solujen elinkelpoisuuden säilyttämistä. Solujen kylmäsäilytys ilman suojaavaa ainetta johtaa solunsisäisten jääkiteiden muodostumiseen, mikä aiheuttaa endogeenisiä mekaanisia vaurioita soluille, aiheuttaa muutoksia solunsisäisen ympäristön osmoottisessa paineessa, pH:ssa, elektrolyyteissä jne. ja sitten edistää solukuolemaa.
4. Huomiota vaativat asiat
(1) Viljelyliuoksen esilämmitys: laita valmisteltu pullo, joka sisältää viljelyliuoksen, PBS:n ja trypsiinin, 37-asteiseen vesihauteeseen esikuumenemaan;
(2) Käytä 75-prosenttista alkoholia erittäin puhtaan työpöydän ja ultraviolettisäteillä säteilytetyn käden pyyhkimiseen;
(3) Käytettyjen instrumenttien oikea sijoitus: varmista riittävä käyttötila, joka ei ole vain helppokäyttöinen, vaan myös vähentää saastumista;
(4) Sytytä alkoholilamppu: huomaa, että liekki ei saa olla liian pieni;
(5) Tiukka aseptinen toiminta;
(6) Kiinnittyneiden solujen kohtalainen pilkkominen: Digestointiaikaan vaikuttavat monet tekijät, kuten digestioliuoksen tyyppi, valmistusaika ja viljelypulloon lisätty määrä. Ruoansulatusprosessin aikana tulee kiinnittää huomiota viljeltyjen solujen muodon muutoksiin. Kun sytoplasma kutistuu, jos yhteys löystyy tai on merkkejä kellumisesta palasina, ruoansulatus on lopetettava välittömästi;
(7) Kaikkien läpikäyneiden kennojen toimenpiteiden tulisi olla mahdollisimman lähellä alkoholilampun liekkiä. On parasta työskennellä vain yhden solun kanssa kerrallaan käyttämällä yhtä laitteistoa jokaista solua kohden. välttää ristiininfektiota;
(8) Kuljetetun kennon pullon suu on steriloitava alkoholilampulla aina, kun se avataan tai suljetaan.
