Mikä on soluviljely?
soluviljelmä
Soluviljelmällä tarkoitetaan prosessia, jossa soluja kasvatetaan kontrolloiduissa olosuhteissa niiden luonnollisen ympäristön ulkopuolella. Se on in vitro -työkalu, joka helpottaa solubiologian ja sairausmekanismien ymmärtämistä. Sillä on myös rooli lääkekehityksessä, kuten lääkkeiden toksisuustestauksessa ja farmakokineettisissä/farmakodynaamisissa tutkimuksissa, sekä henkilökohtaisessa lääketieteessä.
Amerikkalainen embryologi Ross Granville Harrison kehitti ensimmäiset in vitro soluviljelytekniikat 1900-luvun alussa, kun hän kasvatti menestyksekkäästi kudosfragmentteja sammakon alkioista in vitro. Nykyään soluviljelmä on auttanut lukemattomia löytöjä, kuten rokotteiden kehittämistä poliota, tuhkarokkoa, sikotautia ja muita tartuntatauteja vastaan.
Adheesio- ja ripustuskulttuuri
Solujen kasvulle on olemassa kaksi perusjärjestelmää: kiinnittyvä viljely ja suspensioviljelmä. Kiinnittyviä viljelmiä kasvatetaan keinotekoisilla substraateilla, kun taas suspensioviljelmissä olevat solut kelluvat vapaasti väliaineessa. Vaikka vain harvat solutyypit kasvavat luonnollisesti suspensiossa (esim. lymfosyytit), monia kiinnittyviä solutyyppejä voidaan mukauttaa suspensioviljelmään.
Luonnollisesti kiinnittyneiden solujen viljelemiselle suspensiossa on kaksi syytä. Suspensioviljelmän ensimmäinen etu on, että solut on helpompi siirtää, koska sinun ei tarvitse irrottaa niitä entsymaattisesti tai mekaanisesti viljelyastiasta. Toiseksi suspensioviljelmiä on helpompi skaalata, koska solujen kasvua rajoittaa vain niiden pitoisuus alustassa, ei käytettävissä oleva pinta-ala. Suspensioviljelmien suurin haittapuoli on, että ne vaativat päivittäisiä solumääriä ja elinkelpoisuusmäärityksiä kasvumallien seuraamiseksi, kun taas kiinnittyneet viljelmät voidaan helposti tutkia mikroskoopilla.
2D ja 3D menetelmät
Adherentit viljelmät voidaan jakaa edelleen 2D- ja 3D-viljelmiin. 2D-sovelluksissa kiinnittyviä soluja kasvatetaan yksikerroksisessa järjestelmässä tasaisella pinnalla, kuten soluviljelypullossa.
soluviljelmä
Yksinkertaisuudensa vuoksi 2D-tekniikka ei voi jäljitellä solujen in vivo -ympäristöä, jotka tyypillisesti kasvavat kolmiulotteisissa rakenteissa, joissa on monimutkaisia solujen välisiä vuorovaikutuksia. Tästä syystä jotkut kokeet suoritetaan 3D-viljelmillä, joita voidaan kasvattaa telinepohjaisilla tai telineettömillä tekniikoilla.
Telinepohjaisiin 3D-menetelmiin kuuluu tyypillisesti kiinnittyneiden solujen kasvattaminen hydrogeelitelineissä. Joissakin sovelluksissa käytetään myös vaihtoehtoja, kuten biokeraamisia, metalli- tai polymeeritelineitä.
Sferoidien kasvattamiseen käytetään telineettömiä tekniikoita jollakin kolmesta eri menetelmästä:
Forced Float: Lataa solususpensio heikosti tarttuvan polymeeripinnoitetun mikrolevyn kuoppiin. Sitten mikrolevy sentrifugoidaan solujen pakottamiseksi muodostamaan palloja.
Riippuva pisara: Solususpensio ladataan riippuvan pisaralevyn kuoppiin. Kuten nimestä voi päätellä, jousitus roikkuu levyllä pisaraina. Solut aggregoituvat näiden pisaroiden kärjissä ja muodostavat palloja.
Sekoituspohjainen: Solususpensio laitetaan pyörivään bioreaktoriin. Jatkuvasta sekoituksesta johtuen solut eivät kyenneet kiinnittymään seinämiin, jolloin muodostui palloja.
Solukulttuurihaaste
Menetelmien ja tekniikoiden eroista huolimatta kaikilla kokeilla on yksi yhteinen piirre: eläviä soluja on vaikea kasvattaa tarvittava määrä toistettavien tulosten saamiseksi. Siksi seuraavat osiot on omistettu neljälle haasteelle - toistettavuus, saastuminen, toteutettavuus ja siirtyminen automaatioon.
toistettavuus
Yongyue Medicalin tekemän tutkimuksen mukaan yli 70 prosenttia tutkijoista ilmoitti, että he eivät onnistuneet toistamaan toisen tiedemiehen kokeita, ja yli puolet epäonnistui toistamaan omia töitään. Soluviljelymäärityksissä useimmat toistettavuusongelmat johtuvat biologisista eroista solujen kulkujen tai sukupolvien välillä. Toinen suuri ongelma on solulinjojen virheellinen tunnistaminen, ja myös viljelyparametrien epäjohdonmukaisuuksilla on tärkeä rooli.
biologista vaihtelua
Tekijät, kuten satunnaiset mutaatiot tai transkriptiovirheet, voivat vaikuttaa kokeiden toistettavuuteen joka kerta, kun solu jakautuu. Tämän välttämiseksi sinun tulee luoda solupankki uuden projektin alussa.
solupankki
Solupankkitoiminnalla tarkoitetaan tiettyjen solutyyppien erien tallentamista myöhempää käyttöä varten toistettavuuteen vaikuttavien tekijöiden, kuten satunnaisten mutaatioiden tai transkriptiovirheiden, välttämiseksi. Ensimmäinen askel on perustaa pääsolupankki (MBC) kasvattamalla valikoituja kiinnostavia solutyyppejä viljelmässä ja kylmäsäilyttämällä niitä useissa säiliöissä. MBC-erät sulatetaan ja niitä käytetään myöhemmin työsolupankkien (WBC) valmistukseen.
Solulinjojen virheellinen tunnistaminen
Solulinjojen virheellisen tunnistamisen ongelma on ollut tiedossa 1960-luvulta lähtien, jolloin tiedemies kuvasi 19 muun ihmissolulinjan HeLa-solukontaminaation. Varmistaaksesi, että tulokset ovat luotettavia ja mikä tärkeintä, ettet tee vääriä johtopäätöksiä, sinun tulee asettaa karanteeniin kaikki laboratorioon tulevat uudet solulinjat, kunnes niiden alkuperä on varmistettu. Mikä tärkeintä, on suositeltavaa toistaa solulinjan pätevyys ennen kylmäsäilytystä ja jakelua muihin laboratorioihin sekä projektin päätyttyä. Solulinjan vahvistamiseksi sinun tulee ensin tarkistaa, onko se lueteltu väärin tunnistetussa solulinjarekisterissä. Jos sitä ei ole rekisteröity, sinun on silti vahvistettava sen aitous. Ihmisen solulinjoille suositellaan lyhyttä tandem-toistoanalyysiä (STR) (DNA-sormenjälki). Ei-ihmissolulinjoille on saatavilla erilaisia testausmenetelmiä, mukaan lukien karyotyypitys, isoentsyymianalyysi ja mitokondrioiden DNA-tyypitys (DNA-viivakoodaus).
Kulttuuriparametrit
Kolmas toistettavuuteen vaikuttava tekijä ovat viljelyparametrit.
Esimerkiksi happitasot voivat vaikuttaa merkittävästi viljeltyihin soluihin. Hapetukseen vaikuttavia muuttujia, kuten kammion kokoa tai solutiheyttä, ei kuitenkaan aina dokumentoida, eikä niitä siksi voida pitää johdonmukaisina.
Toinen tärkeä viljelyparametri on alusta. Tämä tarjoaa välttämättömiä ravintoaineita, kasvutekijöitä ja hormoneja sekä säätelee pH:ta ja osmoottista painetta. Siksi tärkeintä on, että sen koostumus on aina sama. Tämä on erityisen tärkeää väliaineille, joita on täydennetty fetal bovine seerumilla (FBS), joiden koostumus riippuu tekijöistä, kuten lehmän ruokavaliosta, maantieteellisestä sijainnista ja vuodenajasta. Minimoidaksesi FBS:n vaikutusta tulosten toistettavuuteen sinun tulee tilata eri seerumi-eriä, kun nykyiset varastot alkavat olla vähissä, ja testata niitä löytääksesi lähimmän vastaavuuden. Jotta muut voivat toistaa tuloksesi, sinun tulee raportoida, kuinka seuloit seerumin ja kirjata eränumero.
soluviljelmä
Solujen käsittely
Useimmat tutkijat tietävät, että kulttuuriparametreilla on valtava vaikutus heidän sovelluksiinsa, mutta muutokset käsittelytekniikoissa jäävät usein huomiotta.
Saastuminen
Kun solut eristetään kudoksesta ja kasvatetaan laboratoriossa, immuunijärjestelmä ei enää suojaa niitä, ja siksi ne ovat erittäin alttiita kontaminaatiolle.
Ensimmäinen kontaminaatiolähde on abioottiset kontaminantit, kuten epäpuhtaudet elatusaineessa, seerumissa, ravintolisissä tai vedessä sekä endotoksiinit ja liukenevat aineet. Varotoimiin kuuluu laboratoriolaatuisen veden käyttö soluviljelykokeissa sekä endotoksiinien testaussertifioinnin tarjoavien valmistajien väliaineiden, seerumin, lisäravinteiden ja kulutustarvikkeiden käyttö. Lisäksi kulutustarvikkeiden on oltava neitseellisestä polystyreenistä tai polypropeenista, jotta muovin lisäaineet eivät pääse tihkumaan soluviljelmään.
Toinen saastumisen lähde ovat biologiset kontaminantit, kuten bakteerit (mykoplasma mukaan lukien), sienet ja hiiva.
toteutettavuus
Solujen elinkelpoisuus määritellään elävien solujen osuutena näytteessä. Juuri näkemiemme kontaminanttien lisäksi on monia muita tekijöitä, jotka vaikuttavat solujen elinkelpoisuuteen. Ympäristöolosuhteet – lämpötila, pH, osmoottinen paine, ravinteiden saatavuus sekä O2- ja CO2-pitoisuudet – ovat erittäin tärkeitä. Useimpia näistä muuttujista ohjaa väliaine ja ne ovat solutyyppikohtaisia, mikä valitettavasti tarkoittaa, että emme voi antaa tarkkoja ohjeita.
Koska solut ovat erittäin herkkiä paineelle, sinun tulee kiinnittää huomiota ympäristöolosuhteiden lisäksi myös nesteenkäsittelytekniikoihin.
Viimeinen solujen elinkelpoisuuteen vaikuttava tekijä on vanheneminen. Useimmat äärelliset solulinjat selviävät 20–60 jakautumisesta ennen kuolemaansa, mikä tarkoittaa, että niitä voidaan käyttää uudelleen vain 15–45 sukupolven ajan. Sen jälkeen kylmäsäilytetty näyte on sulatettava solupankista. Jatkuvat solulinjat voivat lisääntyä loputtomasti, mutta koska ne ovat alttiita geneettiselle ajautumiselle, ne tulee vaihtaa säännöllisesti.
Havaitsemismäärityksiä, joissa käytetään kolorimetrisiä, fluorometrisiä ja bioluminesenssimenetelmiä, voidaan käyttää solujen elinkelpoisuuden mittaamiseen. Yleisesti käytetty kolorimetrinen menetelmä on MTT-menetelmä, joka perustuu keltaisten tetratsoliumsuolojen pelkistykseen purppuranpunaisiksi formatsaanikiteiksi elävien solujen toimesta.
96-kuoppalevyt
automaatio
Monet yllä kuvatuista haasteista voidaan ratkaista automatisoimalla soluviljelyn työnkulkuja. Esimerkiksi solujen käsittely on aina johdonmukaista, mikä vaikuttaa positiivisesti toistettavuuteen ja elinkelpoisuuteen. Mikä tärkeintä, automaatio vähentää käyttäjän kontaminaatioriskiä.
Näistä eduista huolimatta kokonaisten työnkulkujen automatisointi voi olla haastavaa budjettisyistä, robottien tilan puutteen vuoksi tai koska ei ole tarpeeksi resursseja automatisoida ja validoida jokaista vaihetta kerralla. Mutta tämä voidaan ratkaista!
