Kun olet juuri valmistunut ja astut työhön, kohtaat joukon substantiivit, jotka kohtaavat reaaliaikaisia kvantitatiivisia PCR-kokeita. Oletko hämmentynyt siitä, mistä aloittaa? Mitä tarkoittaa vahvistuskäyrä, standardikäyrä, kynnys, CT-arvo, sulamiskäyrä ja perusviiva? Näistä kokeista saadut fluoresoivat kuvat ovat liian kirkkaita, mutta en näytä tunnistavan niitä. Tänään viemme sinut oppimaan nämä tiedot ja käsitteet kahdessa osassa: tekniset termit ja usein kysytyt kysymykset.
Osa I Ammattiehdot
1. Vahvistuskäyrä
Amplifikaatiokäyrä viittaa käyrään, jossa syklin numero on abskissa ja reaaliaikainen fluoresenssin intensiteetti reaktion aikana on ordinaatta PCR:n aikana.
2. Perustaso
Perustaso viittaa vähäiseen muutokseen fluoresoivassa signaalissa PCR-amplifikaatioreaktion muutaman ensimmäisen syklin aikana. Signaalin taso näyttää lähellä suoraa viivaa, joka on perusviiva.
3. Fluoresenssikynnyksen asetus
Tyypillisesti PCR-reaktion 15 ensimmäisen syklin fluoresenssisignaalia käytetään fluoresenssin taustasignaalina, ja fluoresenssikynnys on 10 kertaa fluoresenssisignaalin standardipoikkeama 3-15 PCR-jaksojen aikana ja fluoresenssikynnys. asetetaan PCR-monistuksen eksponentiaalisen vaiheen aikana. Tyypillisesti jokaisella instrumentilla on fluoresenssikynnys ennen käyttöä.
4. CT-arvo
CT-arvo edustaa kunkin PCR-reaktioputken syklien määrää, kun fluoresoiva signaali saavuttaa asetetun kynnyksen. Tutkimuksesta tiedämme, että kunkin mallin CT-arvon ja kyseisen mallin aloituskopionumeron logaritmin välillä on lineaarinen suhde. Mitä suurempi alkuperäinen kopionumero, sitä pienempi on CT-arvo ja päinvastoin. Käyttämällä standardeja tunnetuilla aloituskopionumeroilla voidaan tehdä kalibrointikäyrä, jossa abskissa edustaa aloituskopioluvun logaritmia, kun taas ordinaatta edustaa CT-arvoa. Siksi niin kauan kuin tuntemattoman näytteen CT-arvo saadaan, näytteen alkuperäinen kopioluku voidaan laskea standardikäyrästä.
tietää enemmän
On olemassa useita indikaattoreita, joiden avulla voidaan arvioida, onko vahvistuskäyrä hyvä vai ei:
Vastaus: Käyrän käännepiste on ilmeinen, varsinkin vähän raskaan fraktion näytteen eksponentiaalinen vaihe on ilmeinen, vahvistuskäyrän yleinen yhdensuuntaisuus on erittäin hyvä, perusviiva on tasainen, nousevaa ilmiötä ei ole ja vahvistus matalan tason eksponentiaalisen faasikonsentraationäytteen käyrä on erittäin hyvä. ilmeinen.
B: Käyrän eksponentiaalisen vaiheen kaltevuus on suoraan verrannollinen vahvistustehoon, mitä suurempi kulmakerroin, sitä suurempi vahvistustehokkuus.
C: Normaali perusviiva on tasainen tai hieman laskeva, ilman näkyvää noususuuntausta.
D: Kunkin putken vahvistuskäyrien samansuuntaisuus on hyvä, mikä osoittaa, että kunkin reaktioputken vahvistusteho on samanlainen.
5. Sulamiskäyrä
Kun PCR-tuotetta kuumennetaan, lämpötilan noustessa kaksijuosteinen monistustuote dissosioituu vähitellen, mikä johtaa fluoresenssin intensiteetin laskuun. Kun tietty lämpötila saavutetaan, suuri määrä tuotetta erottuu, mikä johtaa jyrkkään fluoresenssin laskuun. Tämän toiminnon käyttäminen yhdessä erilaisten TM-arvojen kanssa eri PCR-tuotteille eroaa myös lämpötilassa, jossa fluoresoiva signaali laskee nopeasti, mikä voi olla hyvä tapa tunnistaa PCR-spesifisyys.
6. Sulamiskäyrä (käyttäen logaritmista käyrää)
Huippukäyrä muodostuu sulamiskäyrän logaritmista, jotta tuotefragmenttien tilanne voidaan näyttää intuitiivisemmin. Koska sulamislämpötila on DNA-fragmentin TM-arvo, voidaan määrittää tietyt DNA-fragmentin TM-arvoon vaikuttavat parametrit, kuten fragmentin koko, GC-pitoisuus jne. Yleensä alukesuunnitteluperiaatteemme mukaan sanotaan yleensä että vahvistetun tuotteen pituus on alueella 80-300bp ja sulamislämpötilan tulee olla 80 - 90 astetta.
V: Jos 80-90 asteen välillä on vain yksi päähuippu, se tarkoittaa, että reaaliaikainen PCR on täydellinen.
B: Jos pääpiikki näkyy välillä 80 astetta ja 90 astetta ja epäpuhtauspiikki alle 80 astetta, pohjimmiltaan harkitaan aluke-dimeeriä. Tämä on hyvä vaihtoehto yrittää ratkaista nostamalla hehkutuslämpötilaa.
C: Jos päähuippu näkyy välillä 80 - 90 astetta ja vaeltava huippu ilmaantuu lämpötilan noustessa, DNA-kontaminaation katsotaan pohjimmiltaan. Ja DNA on poistettava kokeen alkuvaiheessa.
7. Vakiokäyräviiva
Standardistandardit laimennettiin eri pitoisuuksiin ja niitä käytettiin templaatteina PCR-reaktioihin. Standardikäyrä piirretään siten, että abskissana on vakiokopioluvun logaritmi ja ordinaattisesti mitattu CT-arvo. Tuntematonta näytettä kvantifioitaessa näytteen kopionumero voidaan saada standardikäyrästä tuntemattoman näytteen CT-arvon perusteella. Standardikäyrät ovat erittäin tärkeitä absoluuttisen kvantifioinnin kannalta.
toinen osa. yleinen ongelma
K1: Mitä eroa on RT-PCR:n, QPCR:n, reaaliaikaisen PCR:n ja reaaliaikaisen RT-PCR:n välillä?
A1: RT-PCR on käänteistranskriptio-PCR, joka on laajalti käytetty muunnos polymeraasiketjureaktiosta. RT-PCR:ssä RNA-juoste käänteistranskriptoidaan komplementaariseksi DNA:ksi, jota sitten käytetään templaattina PCR:ssä DNA:n monistamiseksi PCR:llä.
Reaaliaikainen PCR ja QPCR ovat sama asia, molemmat ovat reaaliaikaisia kvantitatiivisia PCR:iä, mikä tarkoittaa, että data tallennetaan reaaliajassa jokaisessa syklissä PCR-prosessin aikana. Tällä tavalla käynnistysmallien lukumäärä voidaan analysoida tarkasti.
Vaikka sekä reaaliaikainen PCR että käänteistranskriptio-PCR näyttävät olevan lyhenne RT-PCR, kansainvälinen käytäntö on, että RT-PCR viittaa erityisesti käänteistranskriptio-PCR:ään, kun taas reaaliaikainen PCR on usein lyhennetty qPCR:ksi (Quantitative Real-PCR). True Real-True Real PCR) - aika PCR).
Reaaliaikainen RT-PCR (RT-QPCR) on eräänlainen käänteistranskriptio-PCR, joka yhdistää fluoresoivan kvantitatiivisen tekniikan: ensimmäinen käänteistranskriptio RNA:sta cDNA:n (RT) saamiseksi, jota seuraa kvantitatiivinen analyysi käyttäen reaaliaikaista PCR:ää (QPCR).
Kysymys 2: Miksi fluoresoivan kvantitatiivisen PCR:n monistetun tuotefragmentin pituutta säädetään alueella 80-300 bp?
A2: Jokaisen geenisekvenssin pituus on erilainen, osa niistä on useita kilotavuja ja satoja BP. Suunnitellessamme aluketta meidän tarvitsee kuitenkin vain vaatia tuotteen pituuden olevan 80-300 bp, eikä liian lyhyt tai liian pitkä sovellu kvantitatiiviseen PCR-detektioon.
Tuotefragmentit ovat liian lyhyitä erotettavaksi alukedimeereistä. Aluke-dimeerin pituus on noin 30-40bp, kun se on alle 80 bp, on vaikea erottaa, onko se aluke-dimeeri vai tuote. Jos tuotefragmentti on liian pitkä, yli 300 bp, se johtaa helposti alhaiseen amplifikaatiotehokkuuteen, eikä geenin määrää voida tehokkaasti havaita.
Esimerkiksi kun lasket luokkahuoneessa olevien ihmisten määrän, sinun tarvitsee vain laskea kuinka monta suuta on. Sama pätee geenejä testattaessa. Sinun tarvitsee vain havaita tietty geenisekvenssi edustaaksesi koko sekvenssiä. On helppo tehdä virhe, jos lasket sekä suun että nenän, korvat ja lasit laskeaksesi ihmisiä.
Q3: Mikä on optimaalinen pituus pohjamaalille?
A3: Yleisesti ottaen alukkeiden pituudet alueella 20-24bp ovat hyviä. Pohjusteen TM-arvoon on tietysti kiinnitettävä huomiota aluketta suunniteltaessa, koska se liittyy optimaaliseen hehkutuslämpötilaan. Monien kokeiden jälkeen on todistettu, että 60 astetta on hyvä TM-arvo. Matala hehkutuslämpötila voi helposti johtaa epäspesifiseen vahvistukseen, kun taas korkea hehkutuslämpötila johtaa yleensä alhaiseen vahvistustehokkuuteen, vahvistuskäyrän myöhäiseen huippuun ja viivästyneeseen CT-arvoon.
Kysymys 4: Vaikuttaako kerätyn näytteen määrä koetuloksiin?
A4: Ei. Ilmeisesti mitä enemmän näytteitä kerätään, sitä enemmän RNA:ta uutetaan, sitä enemmän cDNA:ta ja sitä enemmän kohdefragmentteja on. Absoluuttista kvantifiointia varten on tarpeen laskea kohdefragmentin kopioluku, ja kerätyn näytteen määrä vaikuttaa varmasti koetuloksiin. Esimerkiksi hepatiitti C -viruksen HBV:n havaitseminen verestä on HBV-pitoisuuden havaitseminen tietyssä määrässä (1 ml) verta.
Tieteellisessä tutkimuksessa yleisesti käytetyssä suhteellisessa kvantifioinnissa näytteiden määrällä ei ole mitään tekemistä koetulosten kanssa, koska suhteellisella kvantifiointilla tarkoitetaan kohdegeenin ja vertailugeenin vertailua. Pidä niitä vain ylävirran ja alavirran fragmentteina, jotka ovat läsnä samassa nukleiinihappojuosteessa. Jos näytekoko on suuri, sekä referenssi- että kohdegeenejä kasvatetaan samassa suhteessa samaan aikaan, mikä ei vaikuta tuloksiin.
Q5: Vaikuttaako käänteiskopioijaentsyymin tehokkuus koetuloksiin?
A5: Sama kuin yllä. Huomaa, että haluamme korkeamman RT-tehokkuuden, mutta pidämme parempana, että RT-entsyymi on suhteellisen stabiili ja saa tasaiset tulokset. Tämä testaa suurten yritysten käänteisen transkription ohjelmistojen optimoituja ominaisuuksia.
Kysymys 6: Vaikuttaako TAQ-entsyymin tehokkuus koetuloksiin?
A6: TAQ-entsyymin tehokkuus on suhteellisen suuri. Tyypillisesti kuumakäynnistystaq-entsyymejä vaaditaan ja ne ovat suhteellisen tehokkaita. Kaupallisissa fluoresenssin kvantitatiivisissa sarjoissa kukin valmistaja optimoi parhaan tilan tehokkuuden omien tuotteidensa mukaan lähes 100 prosenttia, jos tehokkuus on liian alhainen, kokeellisia tuloksia ei saada. Eri yritysten tuotteille tämä on laadun mitta.
Kysymys 7: Vaikuttaako fluoresoivan väriaineen määrä koetuloksiin?
A7: Kyllä, tulee. Jos fluorokromi on liian kyllästynyt, se voi aiheuttaa kohinahäiriöitä joissakin laitteissa. Jos fluorokromi ei ole kyllästynyt ja fluoresenssiarvo on liian alhainen, se siirtyy tasannevaiheeseen aikaisin ja vahvistuskäyrä on tasainen. Fluoresenssikvantitatiivisessa kokeessa nähdään pääasiassa CT-arvo, joten myöhäisen vahvistuskäyrän ei ole tärkeää päästä tasannevaiheeseen, mutta kuva ei ole tarpeeksi kaunis. Jos sinun oli valittava, aloita valitsemalla fluorokromi, joka on hieman vähemmän kyllästynyt. Käytettäessä saman yrityksen samaa tuotetta sen vaikutus on kuitenkin periaatteessa mitätön.
Kysymys 8: Vaikuttaako PCR-putken lähetys koetuloksiin?
A8: Kyllä. Tämä vaikutus voidaan kuitenkin jättää huomioimatta saman valmistajan saman erän kulutustarvikkeiden osalta. Tämä on hyvä valinta, ja on parasta käyttää 96-kuoppalevyä, jossa on erittäin läpäisevä kalvo, jotta kulutustarvikkeiden valonläpäisykyky minimoi.
Q9: Vaikuttavatko virheet käytön aikana kokeellisiin tuloksiin?
A9: Toimintaprosessin vaikutus näkyy pääasiassa yhtenäisyydessä. Homogeenisuus tarkoittaa, että kaikki järjestelmän komponentit sekoitetaan tasaisesti keskenään, ja pikasentrifugointi voi ratkaista tämän ongelman. Lisäksi aloittelijoille on parasta säätää PCR-järjestelmä yli 20 tuumaksi, ja liian pieni järjestelmä on alttiimpi virheille. Jos hehkutuslämpötila on optimoitu oikein, alukepitoisuuden vaikutus CT:hen on minimoitu. Ja tiedät, että jotkin toimintavirheet (kuten alukkeen pitoisuus) voidaan välttää optimoimalla hehkutuslämpötila.
Tee yhteenveto
Yllä on muutamia kysymyksiä, joita aloittelijat kohtaavat usein kokeilun aikana. Toivomme, että nämä kysymykset voivat auttaa sinua ratkaisemaan hämmennystä. Kokeilu on prosessi, jossa luodaan kaaosta ja ratkaistaan ongelmia, toivottavasti saat siitä jotain irti. Kiitos kun luit ja nähdään ensi kerralla!